【三代纳米孔专题】之进阶篇—Nanopore助力ALK融合基因检测

基因测序技术是对DNA或者RNA进行序列测定的技术，在多种疾病的诊断、治疗、预后等方面都具有重要意义。用于检测体细胞突变的NGS正被广泛运用于肿瘤诊疗相关的分子检测中，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因突变。‍

许多肿瘤的发生都伴随有基因的结构变异，因而结构变异的检测对于疾病的诊断和治疗都有很重要的作用[1]。但目前NGS测序对于结构变异的检测作用有限，三代纳米孔测序（Nanopore sequencing）因为其长读长的测序特点，在结构变异的检测中优势立显。

纳米孔测序的核心是由蛋白质组成的纳米级的小孔。当不同的碱基通过纳米孔时，会产生电流大小的波动。通过对这些波动信号进行记录和分析，可以推测出通过纳米孔的碱基类型，从而完成序列的测定[2]。

纳米孔测序不需要进行DNA聚合酶的链式反应，故不存在DNA聚合酶的失活问题，所以，理论上只要DNA链没有断裂，纳米孔测序就可以一直进行，目前，最长的纳米孔测序达到2Mb以上[2]。因此，纳米孔测序可以检测复杂的结构变异。同时，纳米孔测序是对DNA/RNA进行直接测序，可以直接分析碱基上的表观修饰信息。基于以上特点，纳米孔测序的应用前景广泛。

1、转录本异构体及变异检测

准确检测转录异构体和融合转录本，对疾病的诊断和治疗有很大的作用。但是现有的短读长测序不能完全覆盖转录本，导致异构体的组装和分析都非常困难[3]。

纳米孔测序可以直接对RNA进行测序，读长长，1）可识别和量化复杂的异构体；2）可以分析基因修饰信息。‍

2、基因修饰研究

基因组甲基化与肿瘤的发生有密切的关系，CpG岛甲基化可以导致抑癌基因转录失活，所以，甲基化已经成为表观遗传学的重要内容。与NGS检测甲基化相比，纳米孔测序不需要进行重亚硫酸盐处理样本，可以直接对DNA/RNA进行测序，检测过程更简便，结果更准确[4]。‍

3、结构变异检测

比起单核苷酸变异，结构变异造成的影响更大，更能代表人类群体的多样性特征，一些结构性变异甚至直接导致癌症的发生。发生结构变异的序列复杂性较高，或者有断裂位点的存在，NGS的短读长很难准确检测结构变异，与之相比，纳米孔测序在结构变异方面的检测有很大的优势[5,6]。‍

基于二代测序技术的全基因组测序和全外显子组测序对结构变异等复杂区域检测常常无能为力，原因一是短读长、二是针对高重复区域，PCR聚合酶更易出现错误、三是大部分分析软件识别复杂结构变异能力较差。尤其针对现在临床应用较多的靶向高通量测序来说，这些区域的探针或者引物的设计难度比较大，考虑到富集的特异性，常常会出现覆盖度较差的情况，同样会影响结构变异的检出情况。

基于以上原因，以及实际临床检测中的需求，元码基因首先考虑将融合基因的检测和三代测序相结合，以肺癌中最常见的ALK基因融合为例，在检测过程中，我们发现了一例已知发生EML4-ALK融合，但NGS检测为阴性的样本，具体分析NGS检测为阴性的原因，我们发现该样本的断点位置位于EML4基因13号内含子区域的散在重复序列区域（SINE/LINE），如UCSC下图所示， 在生信分析时会出现EML4端reads比对到多种不同基因的情况，该种非unique比对的reads生信的参数常常会将其过滤掉，造成假阴性的结果。但融合的断点大部分都发生在内含子区域，这种情况不可避免。

我们将该样本作为测试样本，使用Nanopore测序平台进行检测，分别测试了不同的富集方案，例如探针捕获和长片段PCR，以及直接全基因组测序，结果显示不同的实验方案，该特殊样本均可检出融合阳性reads，且经过长片段PCR富集后的阳性reads支持数是最多的。

使用Nanopore三代测序可以避免因为NGS读长短而造成融合基因检出率低的问题，有效提高了融合基因的检出率。

参考文献：

1. Conrad, D. F. et al. Origins and functional impact of copy number variation in the human genome. Nature 464, 704–712 (2010).

2. Oxford Nanopore Technologies：https://nanoporetech.com/

3. Oikonomopoulos, S. et al. Benchmarking of the Oxford Nanopore MinION sequencing for quantitative and qualitative assessment of cDNA populations. Sci Rep. 2016;6

4. Gigante, S. et al. Using long-read sequencing to detect imprinted DNA methylation. 2019.  Nucleic Acids Research. 47(8).

5. Gilpatrick, T. et al. Targeted Nanopore Sequencing with Cas9 for studies of methylation, structural variants, and mutations. BioRxiv. 2019.

6. Stancu, M. C. et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8. 2017.